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本试剂盒是一种利用新型荧光探针O12，可以用于各种动物和植物样本进行组织活性氧检测。本试剂盒中的O12 ROS探针为绿色荧光的活性氧探针，具有488/526nm的最大激发/发射波长，使用荧光分光光度计、荧光酶标仪、等检测O12产物荧光，从而测定组织内活性氧水平。

O12活性氧探针在组织中活性氧存在的条件下，被氧化生成绿色荧光物质，绿色荧光强度与组织内活性氧水平成正比，检测O12产物的荧光就可以知道组织内活性氧的水平。

• 使用方便：可用荧光分光光度计、荧光酶标仪检测；
  
• 背景低，灵敏度高；
  
• 线性范围宽，使用方便。

• 荧光光度计或荧光酶标仪，激发波长488nm，发射波长526±10nm，或者按照FITC荧光检测条件检测。
  
• 离心机、移液器、PBS缓冲液或者HBSS（无酚红）、荧光专用黑色96孔板。

• 螺旋盖微量管装试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• O12染色液为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
  
• 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
  
• 尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。
  
• 必须使用荧光检测专用的黑色96孔板。

• 试剂准备：
  根据样本数量，用纯水将O12探针10倍稀释。充分混匀，备用。
  
  • 不可以一次性将探针全部稀释。
    
  • 现配现用。
• 样本处理：
  
  • 刚取得的新鲜组织样本用PBS洗净。
    
  • 准确称取50mg货100mg组织样本，加入500μL～1mL匀浆缓冲液A，用玻璃匀浆器充分匀浆。
    
  • 在1000×g，4℃离心10分钟，弃沉淀，取上清。
• 样本检测：
  
  • 在96孔板中加入190μL匀浆上清液、10μL O12探针，用移液器吹打，使之充分混匀。
    
    • 不同样本的活性氧差异较大，需要根据预实验结果调整探针用量。一般加入2～10μL探针，染色总浓度按试剂盒探针母液的200～1000倍稀释，200倍稀释适合大多数样本。
      
    • 如果荧光强度太强，超过了检测仪器的量程，可以减少探针用量。保证所有样本探针用量一致即可。
      
    • 以酶标仪检测为例，也可以用荧光分光光度计检测，根据所使用仪器决定匀浆液体积和染色容器。
  • 在37℃避光孵育20～30分钟。
    
  • 置于酶标仪中，后于激发波长为488nm、发射波长526nm检测荧光强度。
    
    • 或使用荧光光度计等其他荧光检测设备。
      
    • 必须使用荧光检测专用的黑色96孔板。
      
    • 如果荧光强度太强，超过了检测仪器的量程，可以将孵育后的匀浆上清液用纯水稀释后再检测。一般稀释5～50倍。保证所有样本稀释倍数一致即可。
• 蛋白定量：
  
  • 另取50μL上清匀浆液，用PBS大约稀释20～30倍。
    
  • 取100μL进行蛋白定量，测定蛋白浓度（mg/ml）。
• 结果处理：
  以荧光强度（RFU）/蛋白浓度（毫克蛋白）表示组织活性氧强度。
  
  • 数据与蛋白浓度的单位无关。
    
  • 此处以蛋白浓度数据作为校正系数，对不同样品进行均一化。
    
  • 荧光强度强则活性氧含量高。
    
  • 可以用实验中对照样本的荧光强度值为基准，待测组样本的荧光强度值占对照样本的百分比来比较活性氧程度差异。